BOTRYTIS sp

 A espécie aqui evidenciada foi isolada num placa com meio de Sabouraud colocada num quarto de uma habitação no âmbito de um protocolo formalizado entre o laboratório de micologia e serviço de pneumologia (consulta de Pneumologia/Patologia do Interstício).

Em seguida transcreve-se o texto elaborado pelos responsáveis do serviço de pneumologia ao qual o laboratório aderiu na medida das disponibilidades técnicas:

"Execução de estudos aerobiológicos domiciliários a fungos

No âmbito da nossa atividade clínica na consulta de Pneumologia/Patologia do Interstício, identificamos ocasionalmente doentes com suspeita clínica de Pneumonite de Hipersensibilidade a fungos, quer por relato de exposição valorizável a manchas/contaminação por bolores dentro da habitação, quer pelo contacto com matérias-primas contaminadas por bolor (p. ex. madeira/lenha) ou quando objetivamos elevação sérica de IgGs específicas a fungos filamentosos. 

Estes doentes desenvolvem uma sensibilização imune (por reação de hipersensibilidade tipo 3 e 4 de Gell e Coombs) a estes antigénios fúngicos, maioritariamente de tipo filamentoso. Sublinho que isto não representa infeção, não sendo comum obtermos isolamento de fungos mesmo em lavado broncoalveolar colhido broncoscopicamente em virtualmente todos eles.

A possibilidade de dispormos de estudo aerobiológico/colheita local adquire uma importância fundamental para o estabelecimento do nexo de causalidade expositivo. Este é um elemento frequentemente decisivo para o escrutínio e estabelecimento do diagnóstico, bem como para alavancar esforços de evicção antigénica (descontaminação/limpeza/medidas de redução do nível de humidade indoor) que terão impacto prognóstico para todos estes doentes. Aproveito para relembrar que a maioria destes doentes se apresenta já com formas fibróticas de Pneumonite de Hipersensibilidade, mostrando uma expectativa de sobrevivência mediana de 5-8 anos.

Secundariamente ao interesse clínico que acabo de explicitar, estes dados permitirão também conhecer a nossa epidemiologia local em termos de contaminação habitacional, com um transfer muito interessante em termos de saúde pública.

Este tipo de colheita será efetuado unicamente para casos de suspeita de Pneumonite de Hipersensibilidade a Fungos, envolvendo sempre que possível uma ida ao domicílio de um elemento da equipa médica. Envolverão o recurso a placas com meio de Sabouraud que gentilmente nos têm dispensado. Sempre que possível, as placas serão deixadas abertas durante um período de 12h nas divisões que se apresentem com maior contaminação visível com bolores. Ocasionalmente poderá ser feito também um pequeno esfregaço com zaragatoa.

Em termos epidemiológicos e clínicos, percebermos se temos Cladosporium sphaerospermum em vez de Cladosporium sp, ou um Penicillium chrysogenum em vez de Penicillium sp pode trazer-nos valor acrescentado. Não só em termos de caraterização epidemiológica (meritória a seu tempo de publicação e difusão científica) como pela capacidade de cruzarmos essa informação com o título de IgG sérica que podemos pedir para alguns dos fungos (Aurabasidium pullulans, Mucor racemosus, Stachybotris atra, Cladosporium cladosporioides, Penicillium notatum/chrysogenum, etc) e disponíveis em kit comercial da Phadia (por ELISA). A esse propósito, é possível garantirem-nos - além do género - também a identificação da espécie precisa dos fungos filamentosos identificados (mesmo que com maior atraso na resposta)?"

Botrytis é um gênero de fungos filamentosos que pertence à família Sclerotiniaceae. Embora mais conhecido por causar doenças em plantas (fitopatologia), algumas espécies de Botrytis têm relevância em micologia médica devido ao seu potencial patogênico em humanos.

Fungo Botrytis cinerea é essencial para a elaboração de vinhos de grande nomeada em diferentes partes do mundo (vinho botritizado), tanto que ficou conhecida como a podridão do bem, ou podridão nobre.

Os níveis de Botrytis na percentagem de todos os fungos têm uma mediana calculada de cerca de 1,1% nos diferentes ambientes, confirmando que se encontra entre os fungos menos prevalentes. Uma proporção substancial de doentes e trabalhadores é alérgica à Botrytis cinerea e, quando a B. cinerea foi incluída em painéis de teste alargados, foram encontrados mais doentes alérgicos. Assim, a B. cinerea é tão importante como os géneros de bolores mais prevalentes Cladosporium e Alternaria pelo que a sua inclusão  em painéis de testes alérgicos pode ser justificada.

Espécies Relevantes em Micologia Médica

• Botrytis cinerea: A espécie mais comumente associada a infecções humanas.
• Outras espécies (como Botrytis elliptica, Botrytis gladiolorum): Raramente relatadas como patógenos em humanos, mas podem causar infecções oportunistas.

Patogenicidade e Infecções em Humanos

• Tipos de infecções:
• Oftalmomicose: Infecções oculares, incluindo queratite, endoftalmite, e orbitite, especialmente em usuários de lentes de contato.
• Sinusite Fúngica: Infecção dos seios paranasais, que pode ser invasiva em indivíduos imunocomprometidos.
• Pneumonia e Outras Infecções Respiratórias: Raras, mas podem ocorrer em pacientes com doenças pulmonares subjacentes ou imunossupressão.
• Infecções Cutâneas e Subcutâneas: Lesões localizadas, geralmente após trauma com contaminação do fungo.
• Fatores de risco para infecção:
• Imunocomprometimento (ex.: HIV/AIDS, quimioterapia, uso de corticosteroides)
• Trauma Ocular ou Cutâneo
• Uso de Lentes de Contato
• Doenças Subjacentes (ex.: asma, doenças pulmonares obstrutivas)

Características culturais e microscópicas

• Cultura:
• Meios de cultura: Ágar Sabouraud com gentamicina e cloranfenicol.
• Condições de Incubação: 25-30°C, por 7-14 dias.
• Morfologia da colónia:
• Tamanho e forma: Colónias de 3-6 cm de diâmetro, circulares, com bordos regulares.
• Superfície: Cinzenta a esverdeada, com uma textura macia e felpuda.
• Reverse: Frequentemente com pigmentação mais escura.
• Características Microscópicas:
• Hifas: Hialinas, septadas, ramificadas.
• Conídios:
• Forma: Ovoides a cilíndricos.
• Tamanho: Geralmente menores que 15 μm.
• Distribuição: Em conidióforos ramificados, formando uma estrutura semelhante a uma uva (donde  o nome Botrytis, do grego "βότρυς" ou botrys, significando " cacho de uvas").

Diagnóstico e tratamento

• Diagnóstico:
• Exame direto: Microscopia de luz após tratamento com KOH.
• Cultura para fungos: Isolamento e identificação da espécie.
• Técnicas moleculares: PCR e sequenciamento para confirmação.
• Tratamento:
• Antifúngicos: derivados azólicos (ex.: itraconazol, voriconazol), polienos (ex.: anfotericina B) e echinocandinas, dependendo da localização e gravidade da infecção.
• Tratamento de suporte: Medidas para aliviar sintomas e prevenir complicações.

Prevenção

• Uso apropriado de lentes de contato
• Higiene ocular e cutânea
• Evitar traumas

Conidióforo e blastoconideos

CUNNINGHAMELLA BERTHOLLETIAE

 Quinze anos se passaram desde que foi isolada no laboratório a última Cunninghamella bertholletiae.

Este isolado ocorreu numa amostra de secreções bronco-pulmonares de um doente de 76 anos com: bronquiectasias. expetoração hemoptoica, cansaço e perda de peso; a imagiologia revelou bronquiectasias, formações cavitadas e áreas de fibrose e retração do parenquima. Pesquisa de micobaterias foi negativa.

Diagnóstico Precoce: É crucial para melhorar o prognóstico. A suspeita clínica deve ser rapidamente confirmada por exames microbiológicos (cultura, PCR) e histopatológicos

Fisiopatologia:

Cunninghamella bertholletiae é um fungo zigomiceto, saprófito comum em solo e matéria orgânica em decomposição.

Modo de Transmissão: A infecção ocorre principalmente por inalação de esporos, podendo também ser adquirida através de feridas na pele.

Patogénese: Após a entrada no organismo, o fungo pode causar uma resposta inflamatória intensa, especialmente em indivíduos imunocomprometidos. A doença pode se manifestar de forma pulmonar, cutânea ou disseminada, dependendo da porta de entrada e do estado imunológico do hospedeiro.

Fatores de Virulência: A capacidade do fungo de sobreviver e se multiplicar dentro de células fagocíticas, como macrófagos, é um fator crucial para a sua patogenicidade. Além disso, a produção de enzimas e toxinas pode contribuir para a destruição tecidual.

Apresentação Clínica:

Infeção Pulmonar: Sintomas iniciais: Febre, tosse, dor torácica, dispneia. Possível evolução para pneumonia, com infiltrados pulmonares visíveis em exames de imagem.

Infeção Cutânea: Lesões cutâneas primárias após trauma com contaminação do fungo. Possível disseminação hematogénica para outros órgãos a partir da lesão cutânea.

Infeção Disseminada: Acometimento de múltiplos órgãos, incluindo sistema nervoso central, rins, fígado, e coração. Frequente em pacientes imunocomprometidos, com quadro clínico grave e rápido progressão.

Prognóstico:

Geralmente Desfavorável: Especialmente em casos de infecção disseminada ou em pacientes com comprometimento imunológico severo.

Taxa de Mortalidade: Alta, variando de 50% a 90% em diferentes estudos, dependendo da população estudada e do atraso no diagnóstico e tratamento.

Fatores que Influenciam o Prognóstico:

• Estado imunológico do paciente.
• Extensão da doença (localizada vs. disseminada).
• Tempo até o início do tratamento adequado

Terapêutica:

• AmB Liposomal
• Posaconazol ou Isavuconazol: Podem ser considerados em casos de intolerância à AmB ou como tratamento de manutenção após a estabilização com AmB.
• Suporte Clínico
• Reabilitação Imunológica

Observação macroscópica da colónia:

As colónias têm um crescimento muito rápido, preenchem toda a placa de petri, inicialmente brancas, mas tornam-se cinzentas escuras e pulverulentas com o desenvolvimento dos esporângios. Esporangióforos com até 20 μm de largura, rectos, com ramos verticilados ou solitários. Vesículas subglobosas a piriformes, as terminais com até 40 µm e as laterais com 10-30 µm de diâmetro. Os esporângios são globosos (7-11 µm de diâmetro), ou elipsoidais (9-13 x 6-10 μm), verrucosos ou curto-echinulados, hialinos isoladamente mas acastanhados em massa.

A observação microscópica do micélio revela:

As hifas largas não septadas ou com raros septos. Os esporangióforos são erectos e formam ramos laterais curtos, cada um dos quais termina numa vesícula inchada. A vesícula tem projeções na sua superfície. Os esporangiolos são redondos a ovais, com um só esporo, e formam-se nestas projeções. Os esporangiósporos são unicelulares, solitários e de forma globosa a ovoide. As paredes dos esporos têm frequentemente cristais em forma de agulha.

Colónia com 6 dias de incubação.

Reverso da colónia

Hifas largas não septadas ou com raros septos

Esporangióforos ramificados

Esporangiósporos soltos

Vesiculas com esporangiolos maduros

TINTELNOTIA DESTRUCTANS

 

O  Tintelnotia destructans é um fungo filamentoso classificado na classe dos Coelomycetes (fungos em que os conídios se formam dentro de uma cavidade revestida por tecido fúngico ou do hospedeiro.). Nesta espécie as estruturas de frutificação são esféricos com uma abertura apical (pycnidia).

Foi descrito pela primeira vez como agente patogénico de queratites em 2016. Está, também, descrito como agente de onicomicoses.

A queratite fúngica ocorre em 0.6 a 1,5 casos por milhão de habitantes por ano (50 a 66% dos pacientes são utilizadores de lentes de contacto). A queratite fúngica é uma doença grave que ameaça a visão

A microscopia confocal pode revelar a presença de hifas de fungos

Esta estirpe foi isolada, em Portugal, numa biópsia de córnea (ulcera da córnea paracentral) e identificada por sequenciação da região ITS. Havia, na mesma localização, um corpo estranho que foi removido.

A terapêutica padrão ainda não está estabelecida. A literatura descreve um perfil de suscetibilidade in vitro com uma MEC elevada contra as equinocandinas; e CIM elevadas para a flucitosina e o fluconazol, mas CIM baixas perante a anfotericina, terbinafina e os triazóis, as CIM comunicadas para a natamicina foram de 2mg/L e para o isavuconazol foram de 4mg/L. Com a combinação da terapêutica antifúngica oral e tópica, a acuidade visual  regressou ao valor inicial.

Tratamento inicial com voriconazol e mais tarde com terbinafina sistémica e tópica, duas semanas depois do inicio da terbinafina a ulcera estava menor, a sintomatologia diminuiu e a acuidade visual melhorou.. 

A observação microscópica do micélio revela a presença de picnídios em forma de frasco, inicialmente hialinos, tornando-se mais tarde castanhos escuros a pretos. Os picnídios contêm conídios hialinos unicelulares fazendo lembrar a microscopia típica dos fungos do género Phoma.

Colónia em Sabouraud GC com 7 dias de incubação a 30 graus.

Reverso da colónia.

Conideomata.

Picnídios contendo conídios hialinos, em fase de libertação através do ostíolo.

 LABORATÓRIO MICOLOGIA

As fotografias deste atlas foram obtidos a partir de estirpes isoladas no laboratório de patologia clínica da unidade local de saúde de Coimbra; a maioria correspondem a casos clínicos que ocorreram na instituição e alguns são de estirpes adquiridas comercialmente. Esta unidade possui um hospital com praticamente todas as valências da medicina - internamento, urgência, hospital de dia e consultas.

O laboratório de micologia faz a identificação de fungos filamentosos através de uma abordagem clássica: informação clínica, observação macroscópica da colónia (velocidade de crescimento, cor, textura e morfologia da colónia em meio de sabouraud com cloranfenicol e gentamicina), e da observação de caraterística microscópicas do micélio. Dispõe de estufas a 25, 30 e 36 graus Celsius.

Os testes de sensibilidade aos anti-fungicos quer pelo método da microdiluição quer por tira de gradiente (E-Teste), são feitos apenas quando a evolução do caso clinico o justifique.

Para identificação de fungos leveduriformes possui aparelho para avaliação da proteómica (maldi-tof).

O serviço de patologia clínica também executa técnicas de biologia molecular como qPCR e sequenciação de  Sanger para identificar estirpes problemáticas ou para elaboração de artigos científicos a publicar.

Para execução das pesquisas/identificação de fungos dermatófitos dispõe de um sistema de biologia molecular (euroarrayprocessor - "chip/array").

Para evidenciação indirecta da infeção fungica dispõe de um método de imunoensaio por difusão lateral para o galactomannan e para o antigénio de Cryptococcus. Está planeada a colocação, a breve prazo, de um aparelho automatizado para pesquisa de: (1-3) beta D glucan, galactomannan e antigénio de Cryptococcus.

Para pesquisa de Pneumocystis executa técnicas de imunofluorescência e de biologia molecular (qPCR).

O serviço de patologia clínica em colaboração com a farmácia do hospital disponibiliza estudos de farmacocinética/farmacodinâmica (doseamento de azóis) e farmacogenómica (perfil metabólico para voriconazol).

TRICHOPHYTON TONSURANS

 

Este é o terceiro "post" sobre o Trichophyton tonsurans e justifica-se pelo grande polimorfismo que as colónias desta espécie podem apresentar, há grandes variações quer na textura quer na cor das colónias. 

O Trichophyton tonsurans é um fungo dermatófito, antropofílico, responsável por lesões inflamatórias (tinhas) e lesões crónicas não inflamatórias da pele, unhas e couro cabeludo. O T. tonsurans é muito contagioso sendo a evicção escolar uma solução a ponderar. Recentemente estão descritos casos de tinhas corporis gladiatorum (pulsos e cotovelos) que surgem em equipas de lutadores (imitam queimaduras em tapete ou escoriações de pele) Nas crianças manifesta-se sobretudo por tinha capitis e nos adultos por tinha corporis.

O T. tonsurans tem uma distribuição mundial mas apresenta um carácter endémico mais acentuado na América latina e na África.

 

As colónias são planas com elevação central, por vezes são pregueadas radialmente. O seu crescimento em cultura é relativamente lento. A textura da colónia varia de granular a algodonosa (camurça) e a cor varia de branco a amarelo claro. O reverso da colónia é amarelo-brilhante (limão) mas pode ser vermelho-acastanhado.

 

Ao  exame microscópico o T. tonsurans apresenta hifas hialinas septadas, numerosos microconideos de variadas formas mas sobretudo piriformes ou em forma de lágrima que fazem com a hifa um  angulo recto - a imagem faz lembrar uma centopeia. As hifas e os microconideos coram mal pelo azul de lactofenol. O T. tonsurans apresenta raramente macroconideos que são em forma de cigarro ou clava com paredes lisas e muitas vezes há formas distorcidas. Clamidosporos intercalares e terminais podem ser observados com frequência. Estão descritos microconideos, grandes, em forma de balão e hifas vazias, situações que nunca ocorrem nem no T. rubrum nem no T. interdigitale que são duas espécies para as quais se coloca a hipótese de diagnóstico diferencial

Em colónias velhas podem ser observados microconideos gigantes e clamidosporos de grandes dimensões.

Recentemente, foi demonstrado, por microscopia electrónica, que estes clamidósporos são na realidade hifas ingorgitadas pela presença de vacúolos e não verdadeiros clamidósporos.

A presença destas estruturas em culturas com 5 dias de incubação atribuem um grau de  92% de sensibilidade e de 93.3% de especificidade na identificação de T. tonsurans (num estudo que incluía estirpes de T. rubrum , T. mentagrophytes e T. verrucosum). Os valores passam a 100% e 60% respectivamente quando as colónias têm 8 dias de incubação.

Nestas condições é licito concluir que a pesquisa de estruturas "clamidósporo-like" é um método barato e eficiente de identificar T. tonsurans.

Colónias com 6 dias de incubação:

Reverso da colónia.

Colónias com 10 dias de incubação.

Reverso da colónia.