LABORATÓRIO MICOLOGIA

As fotografias deste atlas foram obtidos a partir de estirpes isoladas no laboratório de patologia clínica da unidade local de saúde de Coimbra; a maioria correspondem a casos clínicos que ocorreram na instituição e alguns são de estirpes adquiridas comercialmente. Esta unidade possui um hospital com praticamente todas as valências da medicina - internamento, urgência, hospital de dia e consultas.

O laboratório de micologia faz a identificação de fungos filamentosos através de uma abordagem clássica: informação clínica, observação macroscópica da colónia (velocidade de crescimento, cor, textura e morfologia da colónia em meio de sabouraud com cloranfenicol e gentamicina), e da observação de caraterística microscópicas do micélio. Dispõe de estufas a 25, 30 e 36 graus Celsius.

Os testes de sensibilidade aos anti-fungicos quer pelo método da microdiluição quer por tira de gradiente (E-Teste), são feitos apenas quando a evolução do caso clinico o justifique.

Para identificação de fungos leveduriformes possui aparelho para avaliação da proteómica (maldi-tof).

O serviço de patologia clínica também executa técnicas de biologia molecular como qPCR e sequenciação de  Sanger para identificar estirpes problemáticas ou para elaboração de artigos científicos a publicar.

Para execução das pesquisas/identificação de fungos dermatófitos dispõe de um sistema de biologia molecular (euroarrayprocessor - "chip/array").

Para evidenciação indirecta da infeção fungica dispõe de um método de imunoensaio por difusão lateral para o galactomannan e para o antigénio de Cryptococcus. Está planeada a colocação, a breve prazo, de um aparelho automatizado para pesquisa de: (1-3) beta D glucan, galactomannan e antigénio de Cryptococcus.

Para pesquisa de Pneumocystis executa técnicas de imunofluorescência e de biologia molecular (qPCR).

O serviço de patologia clínica em colaboração com a farmácia do hospital disponibiliza estudos de farmacocinética/farmacodinâmica (doseamento de azóis) e farmacogenómica (perfil metabólico para voriconazol).

TRICHOPHYTON TONSURANS

 

Este é o terceiro "post" sobre o Trichophyton tonsurans e justifica-se pelo grande polimorfismo que as colónias desta espécie podem apresentar, há grandes variações quer na textura quer na cor das colónias. 

O Trichophyton tonsurans é um fungo dermatófito, antropofílico, responsável por lesões inflamatórias (tinhas) e lesões crónicas não inflamatórias da pele, unhas e couro cabeludo. O T. tonsurans é muito contagioso sendo a evicção escolar uma solução a ponderar. Recentemente estão descritos casos de tinhas corporis gladiatorum (pulsos e cotovelos) que surgem em equipas de lutadores (imitam queimaduras em tapete ou escoriações de pele) Nas crianças manifesta-se sobretudo por tinha capitis e nos adultos por tinha corporis.

O T. tonsurans tem uma distribuição mundial mas apresenta um carácter endémico mais acentuado na América latina e na África.

 

As colónias são planas com elevação central, por vezes são pregueadas radialmente. O seu crescimento em cultura é relativamente lento. A textura da colónia varia de granular a algodonosa (camurça) e a cor varia de branco a amarelo claro. O reverso da colónia é amarelo-brilhante (limão) mas pode ser vermelho-acastanhado.

 

Ao  exame microscópico o T. tonsurans apresenta hifas hialinas septadas, numerosos microconideos de variadas formas mas sobretudo piriformes ou em forma de lágrima que fazem com a hifa um  angulo recto - a imagem faz lembrar uma centopeia. As hifas e os microconideos coram mal pelo azul de lactofenol. O T. tonsurans apresenta raramente macroconideos que são em forma de cigarro ou clava com paredes lisas e muitas vezes há formas distorcidas. Clamidosporos intercalares e terminais podem ser observados com frequência. Estão descritos microconideos, grandes, em forma de balão e hifas vazias, situações que nunca ocorrem nem no T. rubrum nem no T. interdigitale que são duas espécies para as quais se coloca a hipótese de diagnóstico diferencial

Em colónias velhas podem ser observados microconideos gigantes e clamidosporos de grandes dimensões.

Recentemente, foi demonstrado, por microscopia electrónica, que estes clamidósporos são na realidade hifas ingorgitadas pela presença de vacúolos e não verdadeiros clamidósporos.

A presença destas estruturas em culturas com 5 dias de incubação atribuem um grau de  92% de sensibilidade e de 93.3% de especificidade na identificação de T. tonsurans (num estudo que incluía estirpes de T. rubrum , T. mentagrophytes e T. verrucosum). Os valores passam a 100% e 60% respectivamente quando as colónias têm 8 dias de incubação.

Nestas condições é licito concluir que a pesquisa de estruturas "clamidósporo-like" é um método barato e eficiente de identificar T. tonsurans.

Colónias com 6 dias de incubação:

Reverso da colónia.

Colónias com 10 dias de incubação.

Reverso da colónia.

MEIO DE CULTURA PARA DERMATÓFITOS - FÓRMULA TAPLIN

Todos os fungos apresentados neste blog estão semeados e incubados em placas com meio de Sabouraud suplementado com cloranfenicol e gentamicina - fornecido pela Biomérieux sob a designação de SGC2.

Esta uniformização de meio e de fornecedor é propositada, já que pequenas alterações de composição do meio tanto químicas como físicas (pH) podem alterar o aspeto macroscópico das culturas e a velocidade de crescimento das colónias. 

Praticamente todos os livros e meios de consulta de imagem em micologia médica vão alterando os meios de cultura sem nenhuma lógica aparente nem explicação. Este facto faz com que quando o micologista precisa de ajuda (comparar o seu fungo ao que está no livro) se depara com a necessidade de ter inúmeros meios de cultura diferentes o que na prática do quotidiano é impossível para qualquer empresa que faça gestão de custos.

Resolvi testar o meio DERM com algumas estirpes de dermatófitos no sentido de poder avaliar a eficácia do meio e poder expor a minha opinião, mas desde já adianto que vou continuar a utilizar o SGC2 em exclusividade. Apresento também imagens das culturas obtidas para que possam também ter a vossa própria opinião.

No caso da Biomérieux temos disponíveis dois tipos de meios para fungos: agar SGC2 e agar DERM.

A Biomérieux não recomenda o SGC2 agar para a deteção de dermatófitos, afirma apenas que podem ser utilizados todos os tipos de espécimes, exceto pele e faneros (cabelo, unhas).

O meio da Biomérieux ágar DERM é produzido de acordo com a fórmula de Taplin e é recomendado apenas para a pesquisa de dermatófitos em pele, cabelos e unhas. Este meio além de gentamicina incorpora também cicloheximida bem com peptonas, indicador vermelho de fenol, dextrose e agar.

De acordo com Taplin et al., 2/3 dos dermatófitos mudam a cor do meio, uma vez havendo crescimento, em aproximadamente três dias, mas as colónias podem aparecer mais tarde. Não deitar fora as culturas a 25ºC antes de três semanas. Certas espécies de Candida ou Aspergillus, e certas bactérias, podem crescer no meio e causar uma mudança de cor de amarelo para vermelho. Os dermatófitos produzem metabolitos alcalinos que aumentam o pH do meio e alteram o indicador vermelho de fenol de amarelo para vermelho. A cicloheximida e a gentamicina inibem o crescimento de algumas bactérias, leveduras saprófitas e bolores.

Quando um dermatófito cresce num meio de cultura que contém glucose, não fermenta a glucose, mas utiliza em vez disso os peptídeos e outros ingredientes nitrogenados como fontes de energia, com a consequente produção de subprodutos alcalinos.

 Os sub-produtos provocam aumento do pH que é evidenciado por uma alteração da cor do indicador, a cor amarela original passa para vermelho. Assim, para que um fungo não patogénico desse uma cor “falso-positiva” (vermelha) teria de ser resistente à cicloheximida e não fermentar glucose; e para uma bactéria dar uma cor “falso-positiva” teria de ser resistente à gentamicina e também não fermentar glucose. O cumprimento de ambas as condições é improvável.

ALTERNARIA - INFEÇÃO GLOBO OCULAR

 

Esta estirpe foi isolada no globo ocular de um paciente, a sementeira em sabouraud foi feita  de imediato no local do exame clínico.

A identificação das estirpes de Alternaria representa um grande desafio, a identificação do género sendo aparentemente fácil pelas caraterísticas macro e microscópicas torna-se muito mais complicada se se respeitar as característica de genotipagem, a identificação da espécie sempre foi do domínio molecular (sequenciação).

Atualmente, há quem denomine recorrendo à genotipagem:  "complexo Alternaria" com nove géneros e oito secções. 

A identificação por sequenciação deve ser feita cautelosamente já que as bases de dados apresentam muitas estirpes com erros de identificação.

Em cultura, estes fungos apresentam uma velocidade de crescimento muito díspar entre as várias espécies bem como a capacidade  e a velocidade de produzir conideos é muito variável podendo a estirpe perder a capacidade de formar conideos.

São considerados fungos dematiaceos.

A apresentação macroscópica da colónia é muito variável em cor e tamanho.

Queratites e phaeohiphomicoses bem como onicomicoses são as manifestações clínicas mais frequentes.

Colónia com 5 dias de incubação.